3 野西瓜多糖诱导肿瘤细胞凋亡的研究
3.1 实验材料
3.1.1 细胞株
人胃腺癌细胞(SGC-7901) 人肝癌细胞(HepG-2)
3.1.2 仪器
SANYO MC0175型CO2培养箱
日本三洋公司
JJT-900/1300超净工作台
苏净集团
Adventurer万分之一电子天平
OHAUS公司
旋涡混合器
美国Bohemia N.Y公司
CKX-41-32荧光倒置显微镜
Olympus公司
荧光显微镜
德国Leica 公司
纯水仪
美国Milipore公司
C-4040ZOOM型数码相机
Olympus公司
3.1.3 药品与生化试剂
野西瓜多糖
阿霉素
RPMI 1640、DMDM培养基及胰酶
胎牛血清(FCS)
小牛血清白蛋白(BSA)
医用酒精
碘化丙啶(PI)
核糖核酸酶A(RNase A)
TritonX-100
Hoechst 33258
生理盐水
枸橼酸钠
氯化钾(KCl)
氯化钠(NaCl)
磷酸二氢钾(KH2PO4)
磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)
氯化镁(MgCl2·6H2O)
3.1.4 试剂配制
1×PBS缓冲液(NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 3.63g，KH2PO4 0.24g，加蒸馏水至1000ml，pH7.2-7.4)
PI染液(生理盐水32.4ml，PI 2.5mg，RNase A 0.5mg，TritonX-100 0.25mg，枸橼酸钠 50mg，加蒸馏水至50ml，于棕色容量瓶4℃避光贮存)
Hoechst 33258荧光染液(1mg Hoechst 33258溶于200ml双蒸水中)
3.2 实验方法
3.2.1流式细胞仪检测野西瓜多糖诱导SGC-7901、HepG-2细胞凋亡作用
将对数生长期细胞接种于6孔培养板中，细胞浓度为1×106个/ml，置于37℃，5%CO2条件培养箱中，24h后加入不同浓度的野西瓜多糖；阳性对照组加阿霉素，药物终浓度为5μg/ml；阴性对照组加相同体积的培养液。48h后细胞用胰蛋白酶消化，PBS洗2次，70%冷乙醇固定，置入4℃冰箱中保存12h以上，离心，用PBS液除尽乙醇，离心后的细胞重悬于浓度为50μg/ml PI染液，37℃避光温育30min，300目尼龙网过滤后，在COULTER EPICS-XL型流式细胞细胞仪上测定凋亡细胞所占比例。检测细胞数为104个。激发波长488nm，发射波长630nm。
3.2.2荧光显微镜检测凋亡细胞
取指数生长期的人胃腺癌细胞SGC-7901、人肝癌细胞HepG-2，加入适量0.25%胰蛋白酶液消化细胞，使贴壁细胞脱落。用含10%胎牛血清的培养基制备成浓度为3×105/ml的细胞悬液，于6孔板中每孔接种1ml。将平板置于37℃、5%CO2培养箱。24h后不同浓度的野西瓜多糖，使其终浓度分别；阳性对照组加阿霉素，其终浓度为10μg/ml；阴性对照组加相同体积的培养液。48h后细胞用胰酶消化，加PBS洗一遍，加入固定液(甲醇和冰醋酸的体积比为3∶1) ，置4℃冰箱固定10min后，加入浓度为5mg/l的荧光探针Hoechst33258，置于37℃，5%CO2培养箱中孵育15min，将孔中的盖玻片取出，盖在已滴好甘油的载玻片上，置于荧光倒置显微镜上观察细胞形态并照相。
3.2.3流式细胞仪分析野西瓜多糖对肿瘤细胞细胞周期的影响
取指数生长期的人胃腺癌细胞SGC-7901、人肝癌细胞HepG-2，PBS洗2遍后，加入适量0.25%胰蛋白酶液消化，使贴壁细胞脱落。用含10%胎牛血清的培养基制备成浓度为3×105/ml的细胞悬液，于6孔板中每孔接种1ml。将平板置于37℃、5%CO2培养箱。24h后不同浓度的野西瓜多糖；阳性对照组加阿霉素，其终浓度为10μg/ml；阴性对照组加相同体积的培养液。18h后细胞用胰酶消化，离心收集细胞，细胞沉淀用70%乙醇悬浮，在4℃冰箱固定12h以上。固定后的细胞用PBS洗两遍并悬浮之，加入PI染液(终浓度为50μg/ml)，37℃避光温育30min，300目尼龙网过滤后，在流式细胞细胞仪上计数10,000个细胞，测定细胞各期DNA含量，分析细胞周期(激发波长488nm，发射波长630nm)。
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