2 野西瓜多糖体外抗肿瘤作用研究
2.1 实验材料
2.1.1细胞株
人胃腺癌细胞(SGC-7901) 人肝癌细胞(HepG-2)
2.1.2仪器
SANYO MC0175型CO2培养箱
日本三洋公司
JJT-900/1300超净工作台
苏净集团
Olympus IX70 倒置显微镜
Olympus公司
Adventurer万分之一电子天平
OHAUS公司
WELLSCAN MK 3型酶标仪
美国Bio-Rad公司
旋涡混合器
美国Bohemia N.Y公司
2.1.3药品与生化试剂
野西瓜多糖
青霉素
链霉素
RPMI -1640、DMDM培养基及胰酶
胎牛血清(FCS)
溴化四氮唑蓝(MTT)
硫化罗丹明(SRB)
三羟甲基氨基甲烷(Tris)
三氯乙酸(TCA)
二甲基亚砜(DMSO)
磷酸氢二钠(Na2HPO4)
磷酸二氢钾(KH2PO4)
2.2实验方法
2.2.1 细胞株
实验所用细胞于含5% CO2的37°C培养箱中培养传代，用含10%胎牛血清及100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养液培养；用0.25%胰酶-EDTA消化传代，每周传代两次。
2.2.2 MTT法测定肿瘤细胞的存活率
将对数生长期的细胞用胰酶消化后配制成浓度为1×104个/ml的细胞悬液，按1000个/孔接种于96孔板，每孔加100μl。次日加入含不同浓度药物及相应溶剂对照的新鲜培养基，每孔加100μl(DMSO终浓度<0.5%)，每药设4个剂量组，每组设6个平行孔，给药后于37℃继续培养72h后，弃上清，每孔加100μl新鲜配制的含0.5mg/ml MTT的无血清培养基，继续培养4h，弃上清液，每孔加200μl DMSO溶解MTT甲簪沉淀，用微型振荡器振荡混匀，用MK3型酶标仪在参考波长490nm，检测波长570nm条件下测定光密度值(OD)，以溶剂对照处理的肿瘤细胞为对照组，用下面公式计算药物对肿瘤细胞的抑制率，并按中效方程计算IC50：
抑制率＝
2.2.3 SRB法检测化合物对肿瘤细胞的抑制作用
将对数生长期的细胞用胰酶消化后配制成浓度为2×104个/ml的细胞悬液，按1000个/孔接种于96孔板，每孔加100μl。培养24h后加入待测药物，同时测定此时细胞的OD490值(T0)。加药72h后进行测定：每孔加预冷的50％ TCA液50μl固定(TCA终浓度10%)，静置5min，将96孔板移至4℃放置1h；倒掉固定液，去离子水洗5遍，空气干燥后，每孔加SRB液100μl(用1％醋酸配成4mg/ml溶液)，室温放置10min；1％醋酸洗5遍，空气干燥后，加150μl 10mmol/l非缓冲Tris碱液(pH 10.5)溶解，稳定10min后测定OD490nm值。按中效方程计算细胞50％生长抑制所需的药物浓度(GI50)；细胞完全生长抑制所需的浓度(TGI)；杀死50％细胞所需药物浓度(LC50)。
公式： 生长率%= [(T-T0)/(C-T0)]×100%
细胞杀死率%= [(T-T0)/T0]×100%
GI50：即[(T-T0)/(C-T0)]=50% 时的药物浓度
TGI：即T=T0时的药物浓度
LC50：即[(T-T0)/T0]= - 50% 时的药物浓度
注：C表示对照组细胞的OD值
T表示加药组细胞的OD值
T0表示加药时对照平板细胞的OD值
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