牛膝多糖研究进展
时春娟1，周永达1，张剑波1，田庚元2
(1华东师范大学化学系，上海200062；2中国科学院上海有机化学研究所生命有机化学国家重点实验室， 上海200032)
[摘要] 牛膝多糖是从中药牛膝的干燥根里分离得到的果聚糖，相对分子质量小，水溶性好，易被人体吸收，具有广谱的免疫调节活性。牛膝多糖经结构修饰(硫酸酯化，磷酸酯化，羧甲基化，羟甲基化)后得到的一系列的多糖衍生物显示出更高的活性或新的生理活性，具有广阔的药物开发及应用前景。现对牛膝糖的结构：分离、药理活性、及其衍生化修饰等方面的最新研究进展进行综述。
[关键词] 牛膝多糖；果聚糖；理化性质；药理活性；衍生物
多糖是生物体内一类重要的大分子，除了储存能量和支持结构外，还是一类重要的信息分子，在生物体内起着信息传递的功能。近年来，人们发现一些多糖如香菇多糖。、云芝多糖、茯苓多糖能够治疗免疫系统受到损伤而引发的一些疾病，无毒副作用，是一类有很大开发潜力的免疫调节剂，特别是多糖的一些衍生物，如硫酸酯化多糖，具有抗肿瘤和抗病毒的活性。为此，多糖在医药方面的应用渐渐引起人们的兴趣。
牛膝，是苋科类植物牛膝的干燥根。作为一种传统的活血祛瘀中药，牛膝始载于《神农本草经》，主要分布于河南、山西、河北、山东、四川等地，根据产地的不同，分为怀牛膝(Achyrnthes bidentata Blume)和川牛膝(Cyathula capitata(wall)Mop)，中华人民共和国药(2005年版)上记载：牛膝有补肝肾、强筋骨、逐瘀通经、引血下行之功效，其中怀牛膝以补肝肾见长，川牛膝以活血祛瘀、祛风利湿见长。科学家们从怀牛膝和川牛膝中提取到2种结构不同、相对分子质量较小的多糖，分别命名为怀牛膝多糖(Achyranthes bidentata polysaccharides，AbPS)和川牛膝多糖(RCP)。由于对AbPS的研究较为深入，所以一般意义上的牛膝多糖是指AbPS。现对这2种多糖的研究进展作一简要综述。
1 提取，分离和纯化
牛膝多糖的提取与一般植物多糖的提取方法相同，可经洗净、烘干、粉碎、用水提醇沉，或用丙酮沉淀，再经浓缩，离心和透析，即可得牛膝多糖粗品。
粗牛膝多糖的分离纯化，一般要经过CM-Sephadex C50和Sephadex G50两次纤维柱层析；才可以得到较纯的产品”。巢志茂等还用水性二相体系对牛膝多糖的纯化进行了专门的研究，把水性二相体系用于高度逆流色谱，用聚乙二醇和磷酸钾缓冲液组成水性二相体系，作为色谱的固定相和流动相，通过X—axis CPC 高速逆流色谱仪，成功地从牛膝的水提取高分子物中分离到多糖部分和蛋白质多糖部分，省去了过层析柱等步骤。
不同产地的牛膝，其多糖含量是不一样的，李根林等采用酚-硫酸法测定牛膝中多糖的含量，建立了含量测定方法，并对8个产地的牛膝进行了多糖含量的测定。彭宏宇则采用紫外分光光度法，用苯酚-硫酸显色，对川牛膝中多糖的含量进行了测定。该方法简便、快速、准确、灵敏度高，可作为川牛膝质量控制标准。这些测定多糖含量的方法和结果，给研究人员选择提取粗多糖的原料提供了理论依据。
2 理化性质和结构
纯化后的AbPS为均一多糖，相对分子质量为1300～1400；经完全酸水解后进行高效液相色谱(HPLC)分析，显示AbPS是由果糖和葡萄糖以8:1(物质的量比)组成的，同时相对分子质量分布显示AbPS含有4～21糖；田庚元等运用完全甲基化方法，对甲基化产物进行还原裂解，再辅以谱图分析，于最近报道了AbPS的全分子结构。
Chen等从川牛膝根中提取到3种相对分子质量不同的果聚糖，相对分子质量分别为：5200(COPSl)，3000(CoPS2)，1400(CoPS3)，并利用甲基化-还原裂解的方法，对其结构特征进行了研究，发现这些果聚糖直链较短，支链较多，均含有(2→6)和(2→1)连接的呋喃型β-D-果糖苷键。由于CoPS3显示出抗肿瘤活性，所以对其进行深入的研究：纯化后的CoPS3经HPLC和毛细管电泳(CE)显示组分均一，ESI-MS测得其相对分子质量为1400，HPLC测得单糖的组分为果糖：葡萄糖=21：1(物质的量比)，并通过甲基化—还原断裂的方法，推测CoPS可能为2种结构的混合体：C-Fn型(含葡萄糖)和Fn型(不含葡萄糖)。
Liu等也从川牛膝多糖中提取到一种组分 均一的果聚糖，命名为RCP，相对分子质量主要分布在1000～2200，约由6～12个单糖组成，单糖的组分为D—果糖和D—葡萄糖。结构与CoPS一致，二者可能为同一种多糖。
3 药理作用
3.1 免疫作用
田庚元等用AbPS50mg•kg-1•d-1对S180荷瘤小鼠进行腹腔注射，7d后发现小鼠NK细胞活性显著增高，而AbPS 50～80μg•mL-1可体外增强巨噬细胞对S180的杀伤力。李宗楷等研究了AbPS对老年鼠体外免疫功能的影响。结果表明，AbPS在体外可以提高老年小鼠T淋巴细胞的增殖能力和白细胞介素-2(IL-2)的分泌；体内能显著提高老年大鼠T淋巴细胞和血清中肿瘤坏死因子-β(TNF-β)或TNF-α及一氧化氮(NO)的产生和一氧化氮合酶(NOS)的活性，降低其sIL-2R的产生，改善老年鼠免疫低下的状态，是一种免疫调节剂。吕建新等研究AbPS对体外培养的人胸腔巨噬细胞、内乳酸脱氢酶和酸性磷酸酶活性的调节作用，发现AbPS可诱导巨噬细胞表达细胞因子，并对巨噬细胞具有激活作用。季敬璋等发现AbPS能诱导人T细胞分泌γ干扰素(IFN-γ)，作用效果随时间和剂量的变化而变化，同时能够抑制TL-4的表达；并且在此基础上，对AbPS的免疫调节机制进行了初步的探讨。宁勇等研究发现AbPS能增强单核细胞的吞噬作用，增加单核细胞胞质内溶酶体
量，显著诱导单核细胞表达TNF-α和IL-6，从而对单核细胞具有激活作用。顾梯成等考察了AbPS对小儿反复呼吸道感染的影响，结果表明AbPS能增强免疫细胞的记忆功能，提高机体免疫能力，是防治小儿复感的有效制剂。胡晓光等研究发现牛膝多糖对哮喘Th1／Th2失衡具有免疫调节作用，并且发现这一作用和地塞米松作用相似，在哮喘的治疗中，可以替代地塞米松的一部分作用，同时减轻其不良反应。李祖伦等研究了RCP对实验小鼠红细胞免疫功能的作用，结果表明它既能促进红细胞免疫黏附作用，也能加强红细胞对循环免疫复合物的清除作用。宋军等研究发现，RCP对小鼠肝癌细胞H22(腹水型)有显著的抑制作用。
3.2 抗肿瘤作用
田庚元等用AbPS对S180荷瘤小鼠进行连续7d用药，结果显示多糖对小鼠肉瘤S180的抑制率为31％～40％，与环磷酰胺(单次抑瘤率为17％)合用后，抑瘤率为58％，有明显的协同作用。陈红等研究了RCP对小鼠肉瘤(S180)、小鼠肝癌(H22)的抑制作用以及对环磷酰胺所致正常及荷瘤小鼠外周白细胞减少的影响。结果显示RCP对小鼠肉瘤(S180)和小鼠肝癌(H22)有明显抑制作用；对环磷酰胺所致正常或荷瘤小鼠外周血白细胞减少有极显著的回升作用，说明RCP不仅有抗肿瘤作用，还能减轻环磷酰胺所致外周白细胞减少。
3.3 抗衰老作用
Tan等还对AbPS其他方面的药理活性进行研究，发现它还具有抗衰老的作用。通过DEAE—Sepharose fast—flow柱和SephadexG--100柱，将牛膝粗多糖分为4个组分，分别命名为：Con.1，Con.2，Con.3和Con.4，以果蝇为动物模型研究了该4个AbPS组分的抗衰老作用。结果表明，大分子组分Con.1对果蝇无抗衰老作用，而另3个相对分子质量小的组分在培养基中浓度为2和5mg•g-l(多糖质量／培养基质量)时，都可显著或极显著地使果蝇平均体重增加3.85％～5.47％，并使果蝇平均寿命延长2.61％～3.16％。
梁越欣等研究了AbPS对H2O2诱导2BS细胞衰老模型的影响，发现该多糖能够提高经H2O2处理过2BS细胞的存活率，显示出抗衰老活性。
3.4 抗凝血作用
毛平等研究发现AbPS能延长小鼠凝血时间、大鼠血浆凝血酶原时间、白陶土部分凝血活酶时间，具有凝血作用，同时初步探索了牛膝多糖的活血机制。
3.5 降糖作用
李海泉考察了AbPS对不同高血糖模型小鼠血糖的影响。结果显示AbPS对正常小鼠血糖无明显作用，但显著降低四氧嘧啶及肾上腺素模型小鼠含量，同时可以提高四氧嘧啶模型小鼠肝糖原含量，说明AbPS对高血糖小鼠具有明显降糖作用。
3.6 抑菌作用
彭颖等使用Hela细胞对AbPS进行了黏附试验及黏附抑制试验，考察AbPS是否影响大肠埃希菌对细胞的黏附。结果发现AbPS浓度为0.8mg•mL-1时，对细菌的细胞黏附抑制最为明显，说明AbPS对大肠埃希菌的细胞黏附具有抑制作用。另外，杨青雅等为进一步了解AbPS的特性，保证临床用药的安全有效，还对AbPS的安全性及其制剂的稳定性进行了探索，实验结果显示 AbPS的半数致死量数据可靠，牛膝合剂的有效期可确定为2年。
4 多糖衍生物
虽然牛膝多糖具有多方面的生理活性，但它最主要的作用还是调节机体的免疫功能，而其他活性相对较低，这就限制了它作为多糖类药物的开发利用。鉴于一些多糖经过结构修饰得到的衍生物活性会有很大改善，研究人员在对牛膝多糖药理研究的基础上，还对其衍生物进行了一系列的研究，以期进一步提高牛膝多糖的生物活性，扩大其应用范围，并取得很好的成果。
4.1 硫酸酯化牛膝多糖
硫酸酯化后的多糖往往显示出良好的抗病毒；抗肿瘤活性。为此，田庚元等对AbPS进行硫酸酯化修饰的研究，通过运用不同的硫酸化试剂，确定了最佳反应条件：以氯磺酸—吡啶为硫酸酯化试剂对AbPS进行硫酸酯化，可以得到较高的收率(82.11％)和取代度(3.29)。结构分析显示，多糖分子上的羟基已被最大限度地酯化。并且在抗病毒试验中，该产物表现出很强的抑制乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的活性，对I型单纯性疱疹病毒也有明显的抑制力。
刘颖华等则采用氯磺酸-吡啶法对RCP进行硫酸酯化，得到羟基被部分取代的产物，取代度为0.569，药理实验表明，硫酸酯化后的RCP具有抗单纯疱疹病毒2型(HSV-2)的活性。
4.2 羧甲基化多糖
一些羧甲基化后的多糖衍生物也显示出药理活性的提高和理化性质的改善。邓乐华等以纯的AbPS(>98％)为原料，用ClCH2COOH为羧甲基化试剂，在NaOH水溶液中，对其进行羧甲基化，产物经HPLC分析显示为单一对称性峰；经完全甲基化、酸水解和还原、乙酰化处理后进行GC-MS分析，断定羧甲基化主要发生在果糖的4位上。生物活性测定表明，羧甲基化后的产物具有较好的抑制小鼠lewis肝癌和S180肿瘤的效果，并能提高小鼠NK细胞活性。
4.3 羟烷基化多糖
由于聚乙二醇可以改进生物分子的活性，而羟乙基是聚乙二醇最小的单位，因此对一些多糖或衍生物进行羟乙基化，可以改进其理化性质和药理活性。张健等以环氧乙烷作为羟乙基化试剂，在碱性溶液中对AbPS进行羟乙基修饰，产物经全甲基化后，进行GC-MS分析，确定了取代位置主要在葡萄糖的6位和果糖的6位，取代度为0.30，同时HPLC检测表明产物有较好的纯度和均一性；生物活性实验则显示，较之未取代的AbPS，取代产物对荷lewis肺癌小鼠NK活性有一定提高。
张健还以环氧丙烷为烷基化试剂，同样在碱性水溶液对AbPS进行羟丙基化修饰，得到了取代度为0.15～1.55的产物，结构研究表明，羟烷基优先取代在果糖基的4位，不同取代度的羟烷基化牛膝多糖对小鼠Lewis肺癌和B16黑色素瘤均有明显的抑制作用，同时能促进Lewis肺癌小鼠的NK细胞活性。
4.4 磷酸酯化多糖
对于磷酸酯化的多糖，虽然已有相关研究，但是因为多糖结构的复杂性，所得磷酸酯化的产物取代度很低。Chen等尝试将相关文献报道的对多糖进行磷酸酯化的方法用于AbPS，发现以三氯氧磷(POCl3)为磷酸酯化试剂，二甲基甲酰氨(DMF)为溶剂时，得到的产物取代度较高。药理分析表明：磷酸酯化后的AbPS对植入白鼠体内的腹水瘤细胞S180和lewis肺癌细胞有较强的抑制作用。
此外，由于多糖类衍生物取代度的大小对其理化性质和生理活性均有较大影响，所以，用一种行之有效的方法准确测定衍生物的取代度很重要。为此，胡礼勇等专门对几种测定取代度的方法进行了研究。他们以羧甲基化和羟乙基化牛膝多糖为原料，通过对比各种不同的测定方法，发现酸碱滴定法(ABT)、原子吸收光谱法(AAS)、傅立叶变换红外光谱法(FTIR)和HPLC等方法不但快速简捷，而且精确度和重现性较好，更易于在生产监控和质量检验中应用、推广，为测定多糖衍生物的取代度提供了一种新的思路。
5 结语
作为一类新型的糖药物，牛膝多糖及其衍生物在医药方面的应用正日益引起人们的研究兴趣，特别是其衍生物，很多具有更高或新的活性；且较之灵芝多糖、茯苓多糖等，牛膝多糖相对分子质量小，水溶性好，药源广泛，既可口服，又可注射，作为医药开发应用的前景更为广阔。
除上述提到的衍生物，还可以对其进行其他方面结构的修饰，本实验室就对这方面工作展开了研究，以期发现牛膝多糖衍生物更多的生理活性。通过传统方法和创新方法，目前已经成功合成一系列多糖衍生物，其中包括全乙酰化和部分乙酰化牛膝多糖，以及全硫酸酯化和部分硫酸酯化牛膝多糖，药理研究还在进行中。
责任编辑 lanxieren
