摘要:采用高效液相色谱法(HPLC) 对贵州铜仁丹参基地的丹参药材进行了指纹图谱研究。实验采用Zorbax SB-C18色谱柱(5μm , 416 mm i . d. ×250 mm) ,以乙腈-0.4 %(体积分数) 冰醋酸水溶液为流动相,乙腈的体积分数在70min 内由0 线性增加到40 %;流速110 mL/ min ;柱温25 ℃;检测波长254 nm。以19 个主要共有峰为评价指标,采用国家药品监督管理局推荐的“计算机辅助中药指纹图谱相似度计算软件”计算处理,建立了铜仁地区丹参药材的HPLC 共有指纹图谱。该法操作简单,精密度、稳定性和重现性良好,有助于加强丹参药材的质量控制。
关键词:高效液相色谱;水溶性成分;指纹图谱;丹参
中药丹参为唇形科植物丹参S al vi a mi l t ior-r hiza Bge . 的干燥根及根茎,全国大部分地区均产。其性味苦、微温, 具活血化瘀、安神宁心之功效。其有效成分分脂溶性和水溶性两大类。水溶性成分有增加冠脉流量、抗心肌缺氧作用,同时还具有抗脂质过氧化、清除自由基、治疗慢性肾功能不全等作用。由于其对心血管系统的特殊作用, 已被广泛应用于临床,但仍有很多研究单位继续探索丹参水溶性成分的新工艺制剂。为了掌握丹参水溶性成分制剂的质量,研究人员探讨了定量测定丹参中丹参素和原儿茶醛的方法。但仅仅以丹参素和原儿茶醛的含量来评价丹参注射剂的质量是不全面的。
张文生等、杨文德等、盛龙生等、刘刚等对丹参药材的不同提取组分及丹参注射剂进行了指纹图谱研究,为丹参的质量控制提供了部分科学依据。
丹参品种、产地和采收期的不同会造成其成品质量的差异,为保证产品质量的稳定性,贵州铜仁地区建立了丹参种植基地, 并采用中药材生产质量管理规范(GAP) 管理方式进行管理。为了解基地药材的质量,我们按照国家药品监督管理局颁发的《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行) 》和《中药注射剂色谱指纹图谱试验研究操作规程指南》,采用高效液相色谱法(HPLC) 对铜仁丹参药材基地的丹参药材进行了指纹图谱研究。
1 实验部分
1. 1 仪器与试剂
HP 1100 高效液相色谱仪及Chems tation 色谱工作站; Zorbax SB2C18 色谱柱(5 μm , 416 mm i . d.×250 mm ,SN :USCL010524) 。
乙腈为色谱纯(美国天地公司) ; 水为新鲜乐百氏纯净水(过0145 μm 滤膜) ; 冰醋酸为分析纯(上海化学试剂有限公司) ; 丹参素钠(含量大于98 %)对照品由上海医科大学药学院天然药化室提供, 原儿茶醛购自中国药品生物制品检定所, 批号为0810-200004 ; 1 # ～22 # 丹参药材均采自贵州铜仁丹参药材基地,由贵州神奇制药有限公司提供。
1. 2 色谱条件
以乙腈-0.4 %(体积分数) 冰醋酸水溶液为流动相,梯度洗脱:乙腈的体积分数在70 min 内由0 线性增加到70 %;流速1.0 mL/ min ; 柱温25 ℃; 检测波长254 nm。
1. 3 实验方法
对照品溶液配制:取经减压干燥过夜的丹参素钠、原儿茶醛对照品适量,用水定容作为对照品溶液(含丹参素钠0.387 g/ L ,原儿茶醛0.084 g/ L) 。
样品制备: 称取丹参药材20 g 粉碎, 过40 目筛,于60 ℃减压干燥2 h 。精密称取约2 g ,置于索氏提取器中, 用100 mL 水作提取溶剂, 提取16 h 。将提取液过滤,放冷,定容,摇匀,即得供试品溶液。
2 结果与讨论
2. 1 方法学考察
精密度：取7 # 药材样品制备供试品溶液, 在“1. 2”节色谱条件下, 连续进样5 次,色谱图中各色谱峰的相对保留值的相对标准偏差( RSD) 小于0.84 %,色谱峰面积的RSD 小于1.73 % , 采用国家药品监督管理局推荐的“计算机辅助中药指纹图谱相似度计算软件”(中南大学设计) 计算得5 张色谱图的相似度为0.9 以上,表明仪器精密度良好。
重现性：取1 # 药材样品5 份制备供试品溶液,分别检测,色谱图中各色谱峰相对保留值的RSD 小于1.19 %,色谱峰面积的RSD 小于2.32 %, 5 张色谱图的相似度在0.9 以上,表明方法的重现性良好。
稳定性：取1 # 药材样品制备供试品溶液,分别在样品制备好后0 ,2 ,8 ,12 ,16 ,24 h 进行测定,各主要色谱峰相对保留值的RSD 小于2.43 %,色谱峰面积的RSD 小于2.76 %, 6 张色谱图的相似度在0.9以上,表明供试品在24 h 内稳定。
2. 2 指纹图谱的建立及分析
2. 2. 1 丹参提取物指纹图谱的建立
对12 个丹参药材样品进行了测定,其色谱图有19 个主要的共有特征峰(占总峰面积的90 %以上) ,其典型的HPLC 指纹图谱见图1 。其中1 号峰和3号峰分别是丹参素和原儿茶醛(与对照品对照确认) 。
选择图1 中3 号峰(此峰为所有丹参样品所共有) 为参照峰,分别求出各特征峰的调整保留时间之比(相对保留值,α) 和相对峰面积(峰面积之比) , 结果见表1 。单峰面积与总峰面积的比值大于20 %的共有峰只有14 号峰,其α值为2.39 ; 单峰面积与总峰面积的比值大于10 %的共有峰有8 号峰(α值为1.98) 和16 号峰(α值为2.63) 。在12 个丹参药材样品的水提取物中,3 号、8 号、14 号和16 号峰的峰面积比值误差范围是1 ∶( 2.41 ～ 4.01) ∶( 5.58 ～8.38) ∶(1.85～3.09) 。
2. 2. 2 丹参水提取物的指纹图谱相似度分析
指纹图谱的评价指标是供试品的指纹图谱与该品种的对照指纹图谱(共有模式) 及供试品之间指纹图谱的相似性。我们采用“计算机辅助中药指纹图谱相似度计算软件”对测定结果进行计算,得到丹参水提取物成分的共有指纹图谱。对照共有指纹图谱,10 个丹参药材样品水提取物的相似性分析结果见表2 。
从表2 可以看出,与共有指纹图谱相比,除13 #样品外,其余9 个样品的相似性均在90 %以上, 其中14 # 样品的相似性在99 %以上。为进一步了解13 # 样品与14 # 样品之间的差别, 将两个样品的色谱图做直观比较(见图3) 。可以看出, 两个样品中的14 号峰与16 号峰的相对峰面积差别较大, 其中13 # 样品的14 号峰和16 号峰的相对峰面积分别是1.70 和0.56 ,远远超出了这两个共有峰的相对峰面积误差范围。
3 结论
根据以上分析可知, 以简单测定一个或几个成分含量为主的传统的质量控制方法并不能真正反映中药材的质量,而宏观地综合分析植物药质量将成为必然。色谱技术测定指纹图谱具有综合、宏观的特点,为植物药的质量控制提供了一个有效方法。
本工作在提取条件、色谱条件等方面都经过了大量的实验探索,所建立的方法精密度、稳定性和重现性符合指纹图谱研究的技术要求, 也为丹参药材及其制剂的质量控制提供了部分科学依据。
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