离子交换层析(ionexchangechromatography)是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同，经过交换平衡达到分离的目的的一种柱层析法。该法可以同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，重复性、选择性好，分析速度快等优点，是当前最常用的层析法之一。
(一)基本原理
离子交换层析对物质的分离通常是在一根充填有离子交换剂的玻璃管中进行的。离子交换剂为人工合成的多聚物，其上带有许多可电离基团，根据这些基团所带电荷不同，可分为阴离子交换剂和阳离子交换剂。含有欲被分离的离子的溶液通过离子交换柱时，各种离子即与离子交换剂上的荷电部位竞争性结合。任何离子通过柱时的移动速率决定于与离子交换剂的亲和力、电离程度和溶液中各种竞争性离子的性质和浓度。
离子交换剂是由基质、荷电基团和反离子构成，在水中呈不溶解状态，能释放出反离子。同时它与溶液中的其他离子或离子化合物相互结合，结合后不改变本身和被结合离子或离子化合物的理化性质。
离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物所进行的离子交换反应是可逆的。假定以RA代表阳离子交换剂，在溶液中解离出来的阳离子A+与溶液中的阳离子B+可发生可逆的交换反应，反应式如下：
RA+B+ RB+A+
该反应能以极快的速率达到平衡，平衡的移动遵循质量作用定律。
离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，结合力的大小取决于离子交换剂的选择性。离子交换剂的选择性可用其反应的平衡常数K表示：
K＝[RB][A+]/[RA][B+]。
如果反应溶液中[A+]等于[B+]，则K＝[RB]/[RA]。若K>I，即[RB]>[RA]，表示离子交换剂对B+的结合力大于A+；若K=1，即[RB]＝[RA]，表示离子交换剂对A+和B+的结合力相同；若K<1，即[RB]<[RA]，表示离子交换剂对B+的结合力小于A+。K值是反映离子交换剂对不同离子的结合力或选择性参数，故称K值为离子交换剂对A+和B+的选择系数。
溶液中的离子与交换剂上的离子进行交换，一般来说，电性越强，越易交换。对于阳离子树脂，在常温常压的稀溶液中，交换量随交换离子的电价增大而增大，如Na+<Ca2+<Al3+<Si4+。如原子价数相同，交换量则随交换离子的原子序数的增加而增大，如Li+<Na+<K+<Pb+。在稀溶液中，强碱性树脂的各负电性基团的离子结合力次序是：CH3COO–<F–<OH–<HCOO–<Cl–<SCN–<Br–<CrO42–<NO2–<I–<C2O42–<SO42–<柠檬酸根。弱碱性阴离子交换树脂对各负电性基团结合力的次序为：F–<C1–<Br–=I–＝CH3COO–<MoO42–<PO43–<AsO43–<NO3–<酒石酸根<柠檬酸根<CrO42–<SO42–<OH–。
两性离子如蛋白质、核苷酸、氨基酸等与离子交换剂的结合力，主要决定于它们的理化性质和特定的条件下呈现的离子状态。当pH<pI时，能被阳离子交换剂吸附，反之，当pH>pI时，能被阴离子交换剂吸附。若在相同pI条件下，且pI>pH时，pI越高，碱性越强，就越容易被阳离子交换剂吸附。
离子交换层析就是利用离子交换剂的荷电基团，吸附溶液中相反电荷的离子或离子化合物，被吸附的物质随后为带同类型电荷的其他离子所置换而被洗脱。由于各种离子或离子化合物对交换剂的结合力不同，因而洗脱的速率有快有慢，形成了层析层。
(二)离子交换剂类型及选择
1．离子交换剂的类型
根据离子交换剂中基质的组成及性质，可将其分成两大类：疏水性离子交换剂和亲水性离子交换剂。
(1)疏水性离子交换剂
此类交换剂的基质是一种与水亲和力较小的人工合成树脂，最常见的是由苯乙烯与交联剂二乙烯苯反应生成的聚合物，在此结构中再以共价键引入不同的电荷基团。由于引入电荷基团的性质不同，又可分为阳离子交换树脂、阴离子交换树脂及螯合离子交换树脂。
①阳离子交换剂 阳离子交换剂的电荷基团带负电，反离子带正电，故此类交换剂可与溶液中的阳离子或带正电荷化合物进行交换反应。依据电荷基团的强弱，又可将它分为强酸型、中强酸型及弱酸型三种，各含有以下可解离基团：
这些交换剂在交换时，氢离子为外来的阳离子所取代，如下式所示：
R—COOH + Na+ －－＞R—COONa + H+
②阴离子交换剂 此类交换剂是在基质骨架上引入季胺[—N+(CH3)3]、叔胺[—N(CH3) 2]、仲胺[—NHCH3]和伯胺[—NH2]基团后构成的，依据胺基碱性的强弱，又可分为强碱性(含季胺基)、弱碱性(含叔胺、仲胺基)及中强碱性(既含强碱性基团又含弱碱性基团)三种阴离子交换剂。它们与溶液中的离子进行交换时，反应式为：
R—N+(CH3)3OH–+C1–－－＞R—N+(CH3)3 C1–+ OH–
R—N+(CH3)2 + H2O－－＞R—N+(CH3)2H•OH–
R—N+(CH3)2H • OH +C1–－－＞R—N+(CH3)2H • C1– + OH–
③螯合离子交换剂 这类离子交换树脂具有吸附(或络合)一些金属离子而排斥另一些离子的能力，可通过改变溶液的酸度提高其选择性。由于它的高选择性，只需用很短的树脂柱就可以把欲测的金属离子浓缩并洗脱下来。
疏水性离子交换剂由于含有大量的活性基团，交换容量大、流速快、机械强度大，主要用于分离无机离子、有机酸、核苷、核苷酸及氨基酸等小分子物质，也可用于从蛋白质溶液中除去表面活性剂(如SDS)、去污剂(如TritonX—100)、尿素、两性电解质等。
(2)亲水性离子交换剂
亲水性离子交换剂中的基质为一类天然的或人工合成的化合物，与水亲和性较大，常用的有纤维素、交联葡聚糖及交联琼脂糖等。
①纤维素离子交换剂 纤维素离子交换剂或称离子交换纤维素，是以微晶纤维素为基质，再引入电荷基团构成的。根据引入电荷基团的性质，也可分强酸性、弱酸性、强碱性及弱碱性离子交换剂。纤维素离子交换剂中，最为广泛使用的是二乙胺基乙基(DEAE一)纤维素和羧甲基(CM一)纤维素。近年来Pharmacia公司用微晶纤维素经交联作用，制成了类似凝胶的珠状弱碱性离子交换剂(DEAE—Sephacel)，结构与DEAE一纤维素相同，对蛋白质、核酸、激素及其他生物聚合物都有同等的分辨率。目前常用的纤维素交换剂如表6–1所示。离子交换纤维素适用于分离大分子多价电解质。它具有疏松的微结构，对生物高分子物质(如蛋白质和核酸分子)有较大的穿透性；表面积大，因而有较大的吸附容量。基质是亲水性的，避免了疏水性反应对蛋白质分离的干扰；电荷密度较低，与蛋白质分子结合不牢固，在温和洗脱条件下即可达到分离的目的，不会引起蛋白质的变性。但纤维素分子中只有一小部分羟基被取代，结合在其分子上的解离基团数量不多，故交换容量小，仅为交换树脂的1／10左右。
表6–1离子交换纤维素
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交换剂 （简写） |
类型 |
功能基团 |
交换容量 （毫克当量 /g ） |
时宜工作 pH |
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磷酸纤维素 （ P-C ） |
中强酸型阳离子交换剂 |
— PO 3 2- |
0.7~7.4 |
Ph<4 |
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磺酸乙级纤维素 （ SE-C ） |
强酸型阳离子交换剂 |
— (CH 2 ) 2 SO 3 - |
0.2~0.3 |
极低 |
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羟甲基纤维素（ CM-C ） |
弱酸型阳离子交换剂 |
— CH 2 COO - |
0.5~1.0 |
pH>4 |
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三乙基氨基乙基纤维素（ TEAE-C ） |
强碱型阴离子交换剂 |
— (CH 2 ) 2 N + (C 2 H 5 ) 3 |
0.5~1.0 |
pH>8.6 |
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二乙氨基乙基纤维素（ DEAE-C ） |
弱碱型阴离子交换剂 |
— (CH 2 ) 2 N + H (C 2 H 5 ) 2 |
0.1~1.0 |
pH<8.6 |
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氨基乙基纤维素（ AE-C ） |
中等碱型阴离子交换剂 |
— (CH 2 ) 2 N + H 2 |
0.3~1.0 |
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Ecteda 纤维素（ ECTE-C ） |
中等碱型阴离子交换剂 |
— (CH 2 ) 2 N + (C 2 H 4 OH) 3 |
0.3~0.5 |
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③琼脂糖离子交换剂 主要以交联琼脂糖CL–6B (Sepharose CL–6B)为基质，引入电荷基团而构成。这种离子交换凝胶对pH及温度的变化均较稳定，可在pH3～10和0～70℃范围内使用，改变离子强度或pH时，床体积变化不大。例如，DEAE–Sepharose CL–6B为阴离子交换剂；CM–Sepharose CL–6B为阳离子交换剂。它们的外形呈珠状，网孔大，特别适用于相对分子质量大的蛋白质和核酸等化合物的分离，即使加快流速，也不影响分辨率。
2．离子交换剂的应用选择
应用离子交换层析技术分离物质时，选择理想的离子交换剂是提高得率和分辨率的重要环节。任何一种离子交换剂都不可能适用于所有的样品物质的分离，因此必须根据各类离子交换剂的性质以及待分离物质的理化性质，选择一种最理想的离子交换剂进行层析分离。选择离子交换剂的一般原则如下：
(1)选择阴离子抑或阳离子交换剂，决定于被分离物质所带的电荷性质。如果被分离物质带正电荷，应选择阳离子交换剂；如带负电荷，应选择阴离子交换剂；如被分离物为两性离子，则一般应根据其在稳定pH范围内所带电荷的性质来选择交换剂的种类。
(2)强型离子交换剂适用的pH范围很广，所以常用它来制备去离子水和分离一些在极端pH溶液中解离且较稳定的物质。弱型离子交换剂适用的pH范围狭窄，在pH为中性的溶液中交换容量高，用它分离生命大分子物质时，其活性不易丧失。
(3)离子交换剂处于电中性时常带有一定的反离子，使用时选择何种离子交换剂，取决于交换剂对各种反离子的结合力。为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。据此，强酸型和强碱型离子交换剂应分别选择H型和OH型；弱酸型和弱碱型交换剂应分别选择Na型和C1型。
(4)交换剂的基质是疏水性还是亲水性，对被分离物质有不同的作用性质(如吸附、分子筛、离子或非离子的作用力等)，因此对被分离物质的稳定性和分离效果均有影响。一般认为，在分离生命大分子物质时，选用亲水性基质的交换剂较为合适，它们对被分离物质的吸附和洗脱都比较温和，活性不易破坏。
(三)操作要点
1．交换剂的预处理、再生和转型
商品离子交换树脂为干树脂，要用水浸透使之充分吸水溶胀。又因含有一些水不溶性杂质，所以要用酸、碱处理除去。一般程序如下：干树脂用水浸泡2小时后减压抽去气泡，倾去水，再用大量去离子水洗至澄清，去水后加4倍量的2mol／L HCI溶液，搅拌4小时，除去酸液，用水洗至中性，再加4倍量的2mol／L NaOH溶液，搅拌4小时，除去碱液，用水洗至中性备用。其中处理用的酸碱浓度在不同实验条件下，可以有变动。
如果是亲水型离子交换剂，只能用0．5mol／L NaOH和0．5mol／L NaCl混合溶液或0．5mol／L HCI溶液处理(室温下处理30分钟)。
酸碱处理的次序决定了离子交换剂携带反离子的类型。在每次用酸或碱处理后，均应用水洗至近中性，再用碱或酸处理，最后用水洗至中性，经缓冲溶液平衡后即可使用或装柱。用过的离子交换剂使其恢复原状的方法，称为“再生”。再生时并非每次都用酸碱反复处理，往往只要转型处理就行。所谓转型就是说使用时希望交换剂带何种反离子。长期使用后的树脂含杂质很多，欲将其除掉，应先用沸水处理，然后用酸、碱处理之。树脂若含有脂溶性杂质，可用乙醇或丙酮处理。长期使用过的亲水型离子交换剂的处理，一般只用酸、碱浸泡即可。对琼脂糖离子交换剂的处理，在使用前用蒸馏水漂洗，缓冲溶液平衡后即可。
2．交换剂装柱
(1)离子交换层析柱
实验室中最简单的层析柱可用碱式滴定管代替。一般用玻璃或有机玻璃制成的管，底部熔接有3号烧结滤板，也可用玻璃纤维代替。柱的高度依分离物质的不同而定，当所用的交换剂与待分离物质各组分之间的亲和力相差不多而需要交换剂的体积较大时，以增加柱长为宜，使待分离的组分被洗脱后再结合于交换剂上的概率增加，使性质相近的组分能较好地分离，因而增加了分辨率。柱的直径与高度的比以1：20左右为宜。如采用离子强度较大的梯度洗脱时，以选用粗而短的柱子为宜。因为当柱上洗脱液的离子强度高到足以完全取代被吸附的离子时，这些被置换的离子则以同洗脱液等速率从柱上向下移动，如果柱细长，即从脱附到流出之间的距离长，使脱附的离子扩散的机会增加，结果造成分离峰过宽，降低分辨率。用交联葡聚糖离子交换剂和纤维素离子交换剂时，常用的柱高为15～20cm。
(2)装柱
转型再生好的交换剂先放人烧杯，加入少量水，边搅拌边倒人垂直固定的层析柱中，使交换剂缓慢沉降。交换剂在柱内必须分布均匀，不应有明显的分界线，严防气泡产生，否则将严重影响交换性能。为防止气泡和分界线(即所谓“节”)的出现，在装柱时，可在柱内先加入一定高度的水，一般为柱长的1／3，再加人交换剂就可借水的浮力而缓慢沉降。同时控制排液口放速率，以保持交换剂面上水的高度不变，交换剂就会连续地缓慢沉降，“节”和气泡就不会产生。
离子交换剂的装柱量要依据其全部交换量和待吸附物质的总量来计算。当溶液含有各种杂质时，必须考虑使交换量留有充分余地，实际交换量只能按理论交换量的25％～50％计算。在样品纯度很低时，或有效成分与杂质的性质相近时，实际交换量应控制得更低些。
3．样品上柱、洗脱和收集
装柱完毕，通过恒流泵加入起始缓冲溶液，流洗交换剂，直至流出液的pH与起始缓冲溶液相同。关闭层析柱出液口，准备加样。
打开柱出液口，待缓冲溶液下移至柱床表面时，关闭出液口。用滴管加入已用起始缓冲溶液平衡后的样品。沿柱内壁滴加样品，待样品液加到一定高度后，再移向中央滴加，务必使样品液均匀分布于柱床全表面。然后打开出液口，待样品液全部流人柱床时，先用少量起始缓冲溶液冲洗柱内壁，再接上洗脱装置，按一定速率加入洗脱液，开始层析分离。
一般分析用的样品液上柱量为床容量的1％～2％。制备用的样品量可适当加大。从交换剂上把被吸附的物质洗脱下来，一种方法是增加离子强度，将被吸附的离子置换出来；另一种是改变pH值，使被吸附离子解离度降低，从而减弱其对交换剂的亲和力而被脱附。
由于被吸附的物质不一定是所要求的单一物质，因此除了正确选择洗脱液外，还采用控制流速和分部收集的方法来获得所需的单一物质。因不同物质的极性不同，容易交换的先流出来，根据先后顺序就能得到较纯的物质。
洗脱液的流速不仅与所用交换剂的结构、颗粒大小及数量有关，而且与层析柱的粗细及洗脱液的粘度有关，很难定出一定的标准，必须根据具体条件，反复实验，才能得出适合于特定层析条件的洗脱液流速，一般控制在5～8mL／(cm2•h)。
经洗脱流出的溶液可用部分收集器分部收集，收集的体积一般以柱体积的1％～2％为宜。若降低分部收集体积，可提高分辨率。分部收集洗脱液经相关的检测分析，便可得知所含物质的数量。也可以用监测仪显示收集的洗脱液在特定波长的吸光度(A)代表被分离物质的浓度，以此为纵坐标，以相应的洗脱体积为横坐标，绘制出洗脱曲线。
离子交换层析中的洗脱是至关重要的一步，为了有效地从交换剂上将各种被吸附的物质分阶段洗脱下来，常采用梯度溶液进行洗脱，即所谓梯度洗脱。这种溶液的梯度由盐浓度或pH的变化而形成。前者是用一简单的盐(如NaCl或KCl)溶解于稀缓冲溶液中制成的；后者是用两种不同pH值或不同缓冲溶液制成的。
在某些实验条件下，离子交换层析的洗脱，也选用阶梯式或复合式梯度洗脱液。实践中采用何种形式的梯度洗脱，完全决定于分离要求，无规律可循。一般从线性梯度开始，然后逐步摸索试验，以获得适用于实验的合适洗脱方式。
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